La fazione medicea 'entrò' in Santa Trinita grazie a Francesco Sassetti, amico intimo di Lorenzo il Magnifico, che ottenuta una cappella del transetto destro la fece ornare da Domenico Ghirlandaio con gli affreschi delle Storie di San Francesco e con la pala con l'Adorazione dei pastori (1483-1486); le tombe di Francesco Sassetti e della consorte Nera Corsi vennero eseguite da Giuliano da Sangallo.Nella cappella Sassetti, il Ghirlandaio ha ambientato la scena con il Miracolo del bambino resuscitato nella coeva piazza Santa Trinita, documentando così l'aspetto originario della facciata della chiesa. Alla fine del Cinquecento, nell'ambito di quella renovatio controriformata che i granduchi medicei avevano promosso nelle chiese fiorentine, i Vallombrosani chiesero a Bernardo Buontalenti di rinnovare il presbiterio della chiesa di Santa Trinita e ricostruire il convento. Il complesso assunse così uno stile sobrio e nel contempo imponente. Il Buontalenti, smantellando il coro dei monaci (1574), realizzò così l'artificioso altare monumentale e con l'originale scalinata, conservata ora nel Museo Diocesano di Santo Stefano al Ponte. Nel 1593-1594 il Buontalenti disegnò anche la facciata in pietraforte, corredata di sculture di Giovanni Caccini. Negli stessi anni veniva eretta nel transetto sinistro la cappella delle Reliquie di San Giovanni Gualberto, progettata da Giovanni Caccini con affreschi di Domenico Cresti detto il Passignano. Ulteriori interventi di rinnovamento nelle cappelle furono effettuati da Gherardo Silvani. In occasione dei restauri ottocenteschi tesi a ripristinare l'aspetto gotico, anche a costo di interventi invasivi e deturpanti, quali la rimozione dell'altare del Buontalenti, furono collocate in Santa Trinita anche alcune opere prelevate dalla chiesa di San Pancrazio, ormai sconsacrata: fra queste il grande affresco staccato con San Giovanni Gualberto in trono, Santi e Beati vallombrosani, opera di Neri di Bicci (1455), e la Tomba di Benozzo Federighi eseguita da Luca della Robbia (1450 circa), ora nel transetto sinistro, che però negli spostamenti ha perduto il basamento originario.
Venne fondata nella seconda metà dell'XI secolo appena fuori dell'antica cinta muraria romana e matildina, per iniziativa dei Vallombrosani. Della chiesa romanica rimane traccia nella facciata interna e nella cripta. Fu inclusa nelle mura cittadine del 1172-1175 ed ebbe il titolo di abbazia, diventando un punto di riferimento importante della vita religiosa, ma anche politica e sociale della città. Il prestigio del cenobio vallombrosano era riflesso dalle straordinarie opere artistiche che vi giungevano, alla fine del XIII secolo vi fu collocata la monumentale Maestà di Cimabue, ora agli Uffizi. Nel Trecento la chiesa venne ampliata e ristrutturata, con l'aggiunta fra l'altro delle cappelle laterali, assumendo così l'aspetto odierno. La chiesa, comprese le cappelle, venne rivestita di affreschi, in buona parte distrutti nei rimaneggiamenti successivi.
Fra il 1420 e il 1425 Lorenzo Monaco affrescò le Storie della Vergine nella cappella Bartolini Salimbeni, coprendo precedenti dipinti di Spinello Aretino.
Nello stesso decennio, Lorenzo Ghiberti realizzò la cappella Strozzi (1418-1423), corrispondente all'attuale sagrestia: qui fu realizzata la Tomba di Onofrio Strozzi, ritenuta opera giovanile di Michelozzo, e qui giunse la splendida pala con l'Adorazione dei Magi di Gentile da Fabriano, ora agli Uffizi, datata 1423, mentre Lorenzo Monaco iniziava la Deposizione, poi magnificamente conclusa una decina di anni dopo dal Beato Angelico, ora al Museo di San Marco. Nel 1434, il committente Palla Strozzi venne esiliato per volere di Cosimo il Vecchio, suo avversario politico, che a sua volta era stato esiliato, ma che era tornato trionfante a Firenze. Degli anni sessanta del XV secolo è la dolente, donatelliana Maddalena lignea di Desiderio da Settignano.
